جمشید مشایخی، دارای تحصیلات ناتمام در رشته تئاتر است. وی سال ۱۳۳۶ به استخدام اداره تازه تأسیس هنرهای دراماتیک درآمد و به عنوان بازیگر کار خود را در برنامه نمایشی کانال سوم غیردولتی آغاز کرد و با ایفای نقش در فیلم کوتاه «جلد مار» هژیر داریوش به همراه فخری خوروش جلوی دوربین رفت.در واقع کار حرفه ای خود را از سال ۱۳۴۹ به طور رسمی شروع کرد. بازی جمشید مشایخی در نقش انسان های بی رحم و همچنین نقش های تاریخی همچون «شازده احتجاب»، «کمال الملک» و رضا تفنگچی/خوشنویس در سریال «هزار دستان» نشانگر از توانایی بازیگری اوست. او در سال ۱۳۶۳، بابت بازی در دو فیلم گل های داوودی و کمال الملک، برندهٔ سیمرغ بلورین بهترین بازیگر نقش اول مرد جشنواره فیلم فجر شد. از نمایش های مهم او بازی در نقش «بزرگ آقا» در نمایش میراث کارِ بهرام بیضایی در تالار ۲۵ شهریور در آذر ماه ۱۳۴۶ بود.